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          人臍血間充質干細胞采集、分離純化與保存
          時間:2019-11-06 11:28:29  作者:微微  來源:《微創美容外科學》
          順產或剖宮手術中,在胎兒娩出后距胎兒5~7cm處對臍帶進行雙結扎,剪斷臍帶,消毒斷端,穿刺孕婦端其血管抽取臍血,并用肝素20u/ml抗凝。采集的新鮮血液于18℃保存,于12h內完成細胞分離。

          圖片來源于網絡
           ?。?)采集
            順產或剖宮手術中,在胎兒娩出后距胎兒5~7cm處對臍帶進行雙結扎,剪斷臍帶,消毒斷端,穿刺孕婦端其血管抽取臍血,并用肝素20u/ml抗凝。采集的新鮮血液于18℃保存,于12h內完成細胞分離。采集的血液采集過程中盡可能多的將臍血留在臍帶內,有助于提高hHCB-MSC的培養成功率。單份臍帶采集的血量越多,所能獲得的hHCB-MSC就越多,培養成功的概率也就越大。在采集過程中應小心操作,避免按壓子宮或擠壓臍帶和胎盤。采集時間的控制:采集時間是指從胎兒娩出獲得臍帶血開始,到收集相關細胞并培養至培養皿中所用的時間。為了最大限度地保證干細胞活性,采集時間越短培養效果越好,時間至少控制在15h以內。也有學者認為超過6h即會降低hHCB-MSC的活性而增加其培養難度。
           ?。?)分離純化
            分離臍帶血目前尚無統一的方法,常見的分離方法有以下幾種:
           ?、倜芏忍荻入x心法:將臍血滴加在Ficoll-Hypaque或Perocoll分離液表面進行密度梯度離心分離出血液中的單核細胞。此法簡單易行,但操作步驟過多以及必須使用淋巴細胞分離液,有可能增加hHCB-MSC被污染的風險;
           ?、谫N壁篩選法:利用hHCB-MSC容易在塑料材料上貼壁生長的特性,將其與造血系統細胞及淋巴細胞分離并傳代擴增;
           ?、哿魇郊毎麅x分選法:利用hHCB-MSC大小或細胞表面的特殊標志,采用流式細胞儀對其進行分選,從而獲得目標細胞;
           ?、苊庖叽胖榉蛛x法:利用表面覆蓋有特異性抗體的磁珠與間充質干細胞結合,再用永久磁鐵吸引出間充質干細胞。
            目前常用的分離方式是將密度梯度離心法和貼壁篩選法相結合,先用密度梯度離心法從臍帶血中分離出單個核細胞,再利用hHCB-MSC易貼附在塑料材料上生長的特性,用貼壁篩選法將其從造血細胞中分離出來,從而獲得純度較高的MSCs。
           ?。?)保存
            第六代細胞生長至80%~90%融合時,常規消化、離心,加入含10%二甲基亞砜基礎培養基,調整細胞密度為1*109/L進行梯度凍存。首先置-20℃環境中2~3h,再置-70℃過夜,次日投入液氮保存。6個月后取出凍存管,37℃水浴箱中1~2min解凍,加入基礎培養基混懸后,離心去除二甲基亞砜,再加入基礎培養基,以1*102/L和1*103/L接種至培養皿,置于細胞培養箱中,次日換液,此后3~5d換液一次。
          關鍵字:人臍血間充質干細胞
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